Tecniche di preparazione del liquido seminale
La tecnica di preparazione del liquido seminale ideale è quella che permette di ottenere il maggior numero di spermatozoi mobili morfologicamente normali in un piccolo volume di mezzo di coltura privo di plasma seminale, leucociti e batteri.
Le tecniche di preparazione del liquido seminale finalizzate all´inseminazione, richiedono una densità spermatica superiore a quella necessaria per le tecniche di fecondazione in vitro.
Le principali metodiche utilizzate sono:
- swim-up o migrazione ascendente,
- swim-up da pellet
- gradiente di Percoll
Swim-up o migrazione ascendente
Lo swim-up o migrazione ascendente prevede l’utilizzo di 200-250ml di seme, dopo l’avvenuta liquefazione, e 500-800ml di mezzo di coltura posti in numerose provette con un volume di seme relativamente piccolo così da aumentare l’area totale di interfaccia tra i due componenti. Dopo un adeguato tempo d’incubazione a 37°C (maggiore è il tempo di incubazione e maggiore è la possibilità di recupero di spermatozoi), si rimuove la maggior parte dello strato del terreno di coltura. Normalmente viene aspirato il 70-80% dello strato di terreno di coltura, quindi si procede alla raccolta delle singole aliquote contenute in ciascuna provetta per poi unirle e miscelarle dopo aver accertato la presenza di un’elevata percentuale di spermatozoi mobili (dal 90 al 95%) e l’assenza di contaminazioni. Tutto il preparato è quindi centrifugato a 600 giri per 6-10 minuti, poi risospeso in un terreno di coltura fresco con la percentuale di spermatozoi mobili desiderata. Normalmente questa metodica è utilizzata nei campioni normozoospermici per selezionare gli spermatozoi dotati di maggior motilità.
Swim-up da pellet
Lo swim-up da pellet utilizza un pellet lavato e consta di due o tre diluizioni e centrifugazioni per ottenere un sedimento di spermatozoi al fondo della provetta, che è stratificato in seguito su un terreno di coltura; la provetta è poi incubata a 37°C per permettere agli spermatozoi di risalire dal pellet.
Tali spermatozoi, in teoria, dovrebbero essere più puliti grazie alle fasi di lavaggio iniziale ma in realtà gli spermatozoi danneggiati possono dare effetti nocivi attraverso la produzione di ROS (reactive oxygen species) durante la centrifugazione, provocando una perossidazione lipidica che comporta una riduzione della capacità di fertilizzazione ovocitaria. Questa tecnica è utilizzata soprattutto nei casi di elevata viscosità del liquido seminale o nei casi di ridotta motilità.
Percoll
Le tecniche più diffuse su gradiente di Percoll utilizzano gradienti piccoli e discontinui con due o tre strati; una metodica su gradiente discontinuo di Percoll, con un ridotto volume, è da utilizzare nei casi di oligo-astenospermia grave (< 5 milioni di spermatozoi per eiaculato). Tale gradiente utilizza tre strati da 0.3 mL di Percoll isotonico rispettivamente al 50%, 70% e al 95%; l’utilizzo nelle fasi di lavaggio iniziale di pentossifillina (una molecola antiossidante) determina un miglioramento sostanziale nelle percentuali di fertilizzazione alla IVF.
Gradienti di mini-Percoll sono preparati in provette coniche da centrifuga,caricate con il pellet di spermatozoi lavati e risospesi in 0.3mL di medium di coltura e quindi centrifugati a 300 giri per 30-45 minuti. La separazione in base al gradiente permette di eliminare detriti cellulari ed acellulari, batteri e di recuperare gli spermatozoi mobili,presenti nelle frazioni più concentrate del gradiente e morfologicamente normali localizzati nel sedimento. Questa metodica trova quindi indicazione nei casi di oligoastenospermia severa.
Centro Sterilità e Fecondazione Assistita Università degli Studi di Perugia centrosterilita.it
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