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Lo screening prenatale non invasivo, il futuro della diagnosi prenatale

Sono numerosi gli articoli di divulgazione scientifica apparsi recentemente che descrivono i successi delle nuove tecniche di diagnosi prenatale non invasiva (NIPT: Non Invasive Prenatal Testing). Questo report è limitato al test del DNA fetale applicato alle aneuploide più frequenti perché le evidenze scientifiche, al momento, sono molto robuste solo per questo gruppo di patologie.

Tali tecniche stanno subendo negli ultimi anni un drastico cambiamento, infatti oggi è possibile conoscere il rischio delle più frequenti anomalie cromosomiche (aneuploidie) attraverso un prelievo di sangue materno che è possibile effettuare già dalla decima settimana di gravidanza.

La svolta è arrivata nel 1997 quando un professore di Hong Kong, Dennis Lo, dimostra l’esistenza di piccoli frammenti di DNA circolanti nel sangue materno. La novità fondamentale della scoperta consisteva nel fatto che i frammenti di DNA ritrovati nella mamma erano tipici del sesso maschile (e quindi del cromosoma Y) e pertanto appartenenti inequivocabilmente al feto.

Da allora sono stati fatti enormi passi avanti che hanno portato a recuperare e isolare il DNA libero di origine fetale (cell freeDNA) proveniente però, in realtà, dalla parte più esterna della placenta il cosiddetto trofoblasto, per poi essere esaminato con tecniche di biologia molecolare e di comparazione bioinformatica al fine di ricalcolare mediante algoritmi creati ad hoc, il rischio che il feto sia o meno affetto dalle più comuni aneuploidie (Sindrome di Down, trisomia 13, 18 e aneuploidie dei cromosomi sessuali). Il test inoltre fornisce su richiesta anche l’informazione sul sesso del nascituro.

Già dalla decima settimana di gestazione, nella maggior parte delle gravidanze, la quantità di DNA fetale circolante è sufficiente per eseguire il test. Il test sta avendo un impatto importante sulla riduzione del numero di villocentesi ed amniocentesi che, in tal modo, vengono strategicamente riservate soltanto alle pazienti risultate positive al test del DNA fetale, stando però che la scelta e/o il diritto (secondo le linee guida ministeriali) di eseguire una indagine invasiva rimane del tutto immodificata e comunque soggetta alla opinione medica e del paziente.

Per analizzare le aneuplodie (anomalie del numero di cromosomi) si usano tecniche basate sul sequenziamento di frammenti di DNA, (chiamate Next generation Sequencing-NGS) che si effettua o su tutto il genoma o in maniera selettiva sui frammenti di cromosomi che si vogliono analizzare. I cromosomi oggetto del test vengono detti cromosomi target.

Il DNA circolante viene sequenziato e poi quantificato mediante algoritmi bioinformatici. Semplificando la tecnologia di analisi, che è estremamente sofisticata e richiede competenze bioinformatiche e di biologia molecolare, possiamo distinguere i test in due categorie dette rispettivamente COUNTING e SNPs I due metodi sono estremamente diversi fra loro, per quanto per le aneuplodie più comuni come la Sindrome di Down hanno performance del tutto simili. La differenza risulta però impattante quando ci troviamo di fronte a diversi tipi di gravidanza.

Il metodo SNPs trova la sua applicazione, al momento, unicamente nelle gravidanze singole e che non siano state ottenute da ovodonazione o embriodonazione. Il vantaggio del metodo SNPs è che può identificare una patologia particolare chiamata triploidia ed elimina completamente il segnale del DNA materno che in alcuni casi può essere fuorviante perché in grado di portare a risultati falsamente positivi.

Il metodo Counting ha il vantaggio di lavorare su qualsiasi tipo di gravidanza, incluse le gemellari, le ovodonazioni e le embriodonazioni. Inoltre questo metodo si può usare con i dovuti accorgimenti anche in caso in cui una donna abbia subito un trapianto d’organo o sia soggetta a politrasfusioni.

Qualsiasi tecnica si utilizzi la sensibilità (percentuale di feti portatori della visti del test) del test è elevatissima, intorno 99%, con un rischio quindi bassissimo di falsi negativi (test che fornisce erroneamente risultato negativo in un soggetto malato) . Anche la specificità è considerevole, arrivando a superare il 95-98% abbiamo un numero davvero basso di rischio di falsi positivi (test che risulta positivo alla patologia anche se il soggetto è sano).

Perché il test può sbagliare?

Esistono numerose, quanto rare, cause di falsi positivi e falsi negativi al test che sono state analizzate nel corso degli anni.

Premesso che fra le due, la eventualità assolutamente più probabile sia quella di osservare un “falso positivo” la ragione principale sta nella natura del “tessuto” che si analizza per l’esame. Di fatto, il test non è un esame sul DNA del feto ma della placenta, anzi, del tessuto più esterno della placenta chiamato trofoblasto. In oltre il 98% dei casi il trofoblasto e il feto condividono lo stesso patrimonio genetico e pertanto il test non è soggetto ad errore, ma in alcuni casi la discordanza fra trofoblasto e feto può portare ad un falso positivo (nella maggioranza dei casi) o ad un falso negativo. Tale discordanza però per fortuna è praticamente assente per la patologia che più ci interessa e cioè la Sindrome di Down mentre è leggermente più consistente per altre aneuploidie.

Altre cause di falsi positivi sono presenza di una anomalia o pseudo-anomalia genetica a carico della madre in grado di alterare falsamente il risultato come un mosaico del cromosoma X (tale problema non esiste per il metodo SNPs in quanto come già detto tale metodo elimina il segnale del DNA materno), o ancora la presenza di un organo trapiantato che può portare ad esempio a diagnosticare la presenza di un feto maschio quando in realtà sia una femmina. Ancora, un cosiddetto “vanishing twin” può portare ad amplificare erroneamente un segnale di un feto non più vitale e pertanto più facilmente ammalato quando invece il feto sopravvissuto sia in realtà normale.

Curiosamente esistono casi rarissimi in cui un falso positivo per la Sindome di Down abbia permesso di diagnosticare una aneuploidia clinicamente importante di un altro cromosoma e pertanto abbia prodotto un “falso positivo” vantaggioso.

Ovviamente ciò che più preoccupa i medici e le pazienti sono però le cause di falsi negativi per l’impatto che essi possono avere sull’esito della gravidanza. Va chiarito che i falsi negativi per le aneuploidie sono percentualmente pochissimi e non riguardano praticamente mai la Sindrome di Down. Le cause di falsi negativi sono da ricercare per la maggior parte dei casi nella discordanza fra trofoblasto e feto questa volta in cui però, sfortunatamente, il trofoblasto sia sano mentre il feto sia ammalato. Altre cause si possono osservare in presenza di un mosaico fetale percentualmente molto basso e che quindi possa sfuggire all’esame, o ancora nei casi in cui ci sia un frazione di DNA fetale molto bassa perché il conteggio delle sequenze di DNA in questi casi è più difficile (per inciso va ricordato che nei casi con frazioni fetali basse si potrebbero annidare più facilmente alcune aneuploidie, tant’è che se il test fallisce per due volte è consigliabile eseguire un esame invasivo). D’altra parte va anche ricordato che, indipendentemente dalla possibile presenza di una aneuploidia fetale, nelle pazienti con un BMI molto alto si riscontra più facilmente una bassa frazione fetale. Altre cause di falsi negativi sono dovute ad esempio a quella che si chiama “falsa normalizzazione” e cioè la perdita di un frammento di cromosoma poi rimpiazzato erroneamente da una duplicazione di un altro frammento. In tal caso il segnale totale di quello specifico cromosoma può risultare falsamente normale.

Oggi lo screening non invasivo, molto usato in America, sta rapidamente avendo seguito in Italia proprio in considerazione del fatto che, oltre alla individuazione delle principali anomalie cromosomiche, offre quella di malattie meno conosciute ma molto diffuse, che saranno oggetto di un prossimo report.

Tuttavia è bene sottolineare che questo test non è da considerare diagnostico ma di screening detto “ad alto impatto”. Di fatto lo scopo del test è di ridefinire la probabilità che nel feto sia presente la patologia ricercata. Va notato che alcuni metodi non forniscono un rischio ma una risposta in termini di “positivo” e “negativo”. Sta pertanto sempre nel medico valutare attentamente le refertazioni così come tutti le caratteristiche cliniche caso per caso. In caso di esito positivo le linee guida raccomandano la conferma diagnostica con test invasivi.

 

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